Potencial probiótico de Lactococcus lactis GU967439 aislado de leche cruda: estudios in vitro

Introducción

Los probióticos son microorganismos vivos que, al ser ingeridos en cantidad suficiente, ejercen efectos benéficos en la salud del hospedador. Para seleccionar estas cepas es necesario determinar su seguridad, características fisiológicas y efectos benéficos in vitro previos a la realización de ensayos in vivo (FAO y WHO, 2002). En relación con la seguridad de las bacterias candidatas a probióticos, uno de los principales criterios evaluados es la ausencia de resistencias adquiridas transferibles a antibióticos (Vizoso-Pinto et al., 2006).

La selección de bacterias nativas con propiedades tecnológicas y probióticas es fundamental para el desarrollo de productos lácteos funcionales. Desde el punto de vista tecnológico, las bacterias autóctonas (o nativas) presentan una fase de latencia de crecimiento más corta y son más eficientes acidificando la matriz, siendo de elección para la producción de alimentos fermentados (Torres et al., 2019). Los probióticos deben resistir a la presencia de enzimas en la cavidad oral, al pH ácido en el estómago y a la presencia de bilis en el duodeno (Kimoto-Nira et al., 2010) para llegar viables y en cantidad suficiente al intestino grueso, donde la mayoría de estos microorganismos desempeña su rol benéfico (Mainville et al., 2005). Entre los beneficios asociados a los probióticos se destaca el control de patógenos intestinales por la producción de compuestos antimicrobianos, entre ellos: ácido láctico y acético, peróxido de hidrógeno y bacteriocinas (péptidos con capacidad antimicrobiana) (Stoyanova et al., 2012).

Las bacterias probióticas más utilizadas son Lactobacillus spp., un género de bacterias ácidolácticas (BAL) y bifidobacterias. Las BAL se encuentran en ambientes muy nutritivos como la leche, la carne o los vegetales, y son los microorganismos más utilizados en el procesamiento de alimentos fermentados (Atanassova et al., 2003, Hladíková et al., 2012). Muchas investigaciones se han enfocado tanto en optimizar la participación de las BAL durante los procesos de elaboración como en ampliar sus aplicaciones utilizándolas como probióticos.

Lactococcus lactis, una de las BAL utilizadas en la elaboración de alimentos lácteos fermentados, posee actividad antimicrobiana y se ha sugerido su uso en la producción de alimentos funcionales (Zhou et al., 2010). Anteriormente, algunos autores comprobaron la actividad antilisterial in vitro y en quesos de L. lactis GU967439 aislada de leche cruda proveniente de una quesería artesanal de Nueva Helvecia, Colonia, Uruguay (Fraga, et al., 2013, González-Revello et al., 2016). Para continuar caracterizando la cepa, el presente trabajo se propuso evaluar la resistencia a antibióticos, el efecto del pasaje por el tracto gastrointestinal y la actividad antimicrobiana in vitro de la cepa nativa de L. lactis GU967439.

Materiales y Métodos

Cepas bacterianas

Se utilizó L. lactis GU967439, aislada de leche cruda proveniente de una quesería artesanal de Nueva Helvecia, Colonia, Uruguay, y la cepa de referencia American Type Culture Collection (ATCC) Nº 11454 de L. lactis.

Sensibilidad a antibióticos

Se determinó la sensibilidad a antibióticos siguiendo el método de difusión de Kirby–Bauer con modificaciones propuestas por Ture y Boran (2015). Se suspendieron colonias aisladas de cultivos frescos de L. lactis en diluyente estéril (NaCl 0,85 %) para lograr una turbidez similar a 0,5 de la escala Mc Farland (1,5 x 10⁸ UFC/mL aproximadamente). Las suspensiones fueron inoculadas con hisopos estériles en placas que contenían Müller-Hinton agar (HiMedia®, India). Posteriormente, se depositaron discos con antibiótico (Oxoid Ltd., Basingstoke, UK) utilizando pinzas estériles, y se incubaron en estufa a 30 ℃ en aerobiosis, durante 24 horas. Los discos utilizados contenían uno de los siguientes antibióticos (microgramos/disco): penicilina (10 U), ampicilina (10 µg), piperacilina (100 µg), carbenicilina (100 µg), amoxicilina y clavulánico (30 µg), cefalotina (30 µg), cefradina (30 µg), cefuroxima (30 µg), cefepima (30 µg), cefotaxima (30 µg), ceftazidima (30 µg), cefoperazona (75 µg), imipenem (10 µg), aztreonam (30 µg), teicoplanina (30 µg), amicacina (30 µg), gentamicina (120 µg), kanamicina (30 µg), neomicina (30 µg), estreptomicina (10 µg), tobramicina (10 µg), telitromicina (15 µg), doxiciclina (30 µg), linezolid (30 µg), clindamicina (2 µg), cloranfenicol (30µg), ácido nalidixílico (30 µg), moxifloxacina (5 µg), levofloxacina (5 µg), pefloxacina (5 µg), colistin (10 µg), eritromicina (5 µg), vancomicina (5 µg) y tetraciclina (30 µg).

La lectura se realizó midiendo los halos de inhibición en milímetros, incluyendo el diámetro de los discos de antibióticos, y se clasificaron en resistentes, moderadamente sensibles y sensibles, según Charteris et al. (1998a), Clinical & Laboratory Standards Institute (CLSI, 2009), Cetinkaya et al. (2012), Khemariya et al. (2013), Haghshenas et al. (2014), y Ture y Boran (2015).

Resistencia a la simulación del pasaje por el tracto gastrointestinal

Resistencia a jugos gástricos y pancreáticos

La tolerancia a los jugos gástricos y pancreáticos se testeó de acuerdo a la metodología propuesta por Charteris et al. (1998b), con algunas modificaciones (Monteagudo-Mera et al., 2012). Se simuló el jugo gástrico suspendiendo pepsina porcina (Sigma, USA) en solución fisiológica salina (NaCl, 0,5 %, p/v) a una concentración final de 3 g/L y se ajustó el pH a 2, 2,5 y 3 con HCl 5M. El jugo pancreático se preparó suspendiendo pancreatina en una solución salina estéril (0.5 % NaCl, p/v) a una concentración final de 1 g/L y ajustando el pH a 8,0 con NaOH 5M.

Se obtuvieron cultivos overnight (concentración aproximada de 1 x 10⁸ UFC/mL) de L. lactis en caldo MRS (HiMedia®, India), y se tomaron alícuotas de 1,0 mL en tubos tipo eppendorf estériles, que fueron centrifugados (10000 RPM, 10 minutos, 4 ℃) y lavados 2 veces con PBS (10 Mm, pH 7). Los pellets de células fueron resuspendidos en 0,3 mL de NaCl (0,5 % p/v) y adicionados con 1 mL de solución gástrica o pancreática, y luego incubados en baño María a 37 ℃ durante 120 y 240 minutos respectivamente.

Se realizaron recuentos de células viables en MRS agar (HiMedia®, India) de los cultivos overnight y posterior a la incubación. Finalmente, se determinó la tasa de supervivencia de L. lactis luego de la incubación a pH 2, 2,5 y 3 de acuerdo a la siguiente ecuación:

Tolerancia a las sales biliares

Para evaluar la tolerancia a las sales biliares se utilizó el método propuesto por Maragkoudakis et al. (2006). Se obtuvieron cultivos overnight que fueron centrifugados y lavados de la misma manera que para el ensayo anterior, y luego resuspendidos en 5 mL de caldo MRS (HiMedia®, India) suplementado con bilis bovina al 0,3 % para obtener una concentración aproximada de 2 x 10⁷ UFC/mL. La suspensión se incubó a baño María a 37 ℃ por 240 minutos. Se tomaron alícuotas (0,1 mL) de cada cultivo previo a la incubación y luego de la misma para realizar recuento de células viables en MRS agar (HiMedia®, India), y se calculó la tasa de supervivencia.

Actividad antimicrobiana

La capacidad antimicrobiana se evaluó mediante el método Agar well diffusion (Fraga, 2008) frente a los siguientes microorganismos: Staphylococcus aureus ATCC 6538, Staphylococcus aureus ATCC 29213, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Listeria innocua ATCC 33090, Streptococcus bovis 2.5 (WT), Escherichia coli ATCC 25922 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027.

Para ello, se utilizaron 25 mL de caldo Brain Heart Infusion (BHI, HiMedia®, India) para S. aureus, E. coli, E. faecalis y P. auriginosas, caldo BHI suplementado con 0,6 % (p/v) de extracto de levadura para L. innocua y caldo MRS para S. bovis, adicionados de agar al 0,8 %. Los medios fundidos y atemperados a 45 ℃ fueron inoculados con cultivos overnight de los microorganismos indicadores, obteniendo una concentración final aproximada de 10⁶ UFC/mL y dispuestos en placas de Petri que contenían cilindros metálicos de 10 mm. Una vez solidificado el medio de cultivo, se retiraron los cilindros quedando en su lugar pocillos que fueron inoculados con 100 µl de diluciones seriadas (¹⁄₂, ¹⁄₄, ¹⁄₈, ¹⁄₁₆, ¹⁄₃₂, etc.), con solución buffer fosfato estéril (PBS, 10 Mm pH 7) del sobrenadante libre de células (SLC) de L. lactis.

El SLC se obtuvo de la siguiente manera: a partir de un cultivo overnight de L. lactis en caldo MRS, se inoculó un matraz que contenía 100 mL de caldo MRS para obtener una concentración aproximada de 1 x 10³ UFC/mL y se incubó a 30 ℃ durante 11 horas en aerobiosis. Se determinó el recuento de L. lactis tras la incubación mediante siembra de gotas en superficie en MRS agar, y se incubaron a 30 ℃, durante 24 horas en microaerofilia. Posteriormente, se obtuvieron alícuotas de 1,5 mL en tubos tipo eppendorf estériles y fueron tratados con ondas de ultrasonido (Jeken®, Digital Ultrasonic Cleaner PS-06ª, 50W, 40 kHz, 160 segundos) para favorecer la liberación de bacteriocinas adsorbidas a las células productoras (Rodríguez, 2016). Por último, el SLC se obtuvo centrifugando los cultivos a 10000 RPM durante 15 minutos a 4 ℃ y se ajustó a pH 6 con NaOH 1M para eliminar el efecto inhibitorio de los ácidos orgánicos. Se utilizó 100 μL de Nisina (Nisaplin®, Danisco) en una concentración de 100 mg/mL como control positivo y 100 μL de MRS ajustado a pH 6 con NaOH 1M como control negativo. Las placas fueron incubadas en aerobiosis a 37 ℃ durante 24 horas y la producción de bacteriocinas se expresó en unidades arbitrarias de actividad por mililitro (UA/mL), definidas como el inverso de la dilución más alta que presentó halo de inhibición de crecimiento (Schillinger y Lucke, 1991).

Análisis estadísticos

La resistencia al jugo gástrico a pH 2, 2,5 y 3 se analizó mediante el test de Student de 2 colas y la resistencia a la pancreatina y bilis se analizó utilizando el test de Welch. La actividad antimicrobiana de L. lactis GU967439 y ATCC Nº 11454 se comparó mediante el test de Mann Whitney. Los análisis fueron realizados utilizando el software Rstudio (versión 4.3.2). Para todos los casos se utilizó α = 0.05, y los ensayos se realizaron por triplicado de forma independiente.

Resultados

Sensibilidad a antibióticos

L. lactis ATCC N° 11454 y GU967439 fueron sensibles a todos los antibióticos activos frente a microorganismos Gram positivos y fueron resistentes al ácido nalidixílico, colistina, estreptomicina y aztreonam.

Resistencia a la simulación del pasaje por el tracto gastrointestinal

En la Tabla 1 se observa el efecto de la simulación de los jugos gástricos a distintos valores de pH (3, 2,5 y 2) en el recuento de células viables (expresado como log10UFC), la tasa supervivencia y la comparación entre los recuentos iniciales y finales tras 120 minutos de incubación de las cepas de L. lactis.

Las cepas presentaron una reducción significativa de células viables en la simulación del jugo gástrico a valores de pH de 2 y 2,5; sin embargo, ambas mostraron células viables.

Finalmente, no se observaron diferencias significativas (p > 0.05) en el recuento de células viables tras la incubación de L. lactis en presencia de pancreatina o bilis.

Actividad antimicrobiana

En la Tabla 4 se muestra la actividad inhibitoria del SLC de las cepas de L. lactis expresada como medianas de UA/mL frente a cada microorganismo indicador, y la comparación de la actividad entre las cepas de L. lactis.

El SLC de L. lactis GU967439 fue capaz de inhibir todos los microorganismos Gram positivos utilizados como indicadores y mostró mejor actividad que el de L. lactis ATCC N° 11454 (p < 0.05). Por otro lado, ninguna de las cepas presentó actividad frente a los microorganismos Gram negativos utilizados como indicadores.

Discusión

Sensibilidad a antibióticos

Las bacterias multirresistentes constituyen una amenaza emergente para el sistema alimentario. Las bacterias probióticas pueden participar en la transferencia de genes resistentes a antibióticos a la microbiota patógena o comensal del intestino, lo que incrementa la necesidad de evaluar la seguridad de los microorganismos utilizados (Selvin et al., 2020). La expresión del mismo patrón de sensibilidad en L. lactis GU967439 y ATCC 11454 sugiere que L. lactis GU967439 no adquirió elementos de resistencia a antibióticos.

Resistencia a la simulación del pasaje por el tracto gastrointestinal

Las cepas bacterianas probióticas deben sobrevivir a condiciones desfavorables durante su pasaje por el tracto gastrointestinal para ser capaces de colonizar el colon y ejercer un efecto benéfico en la salud del consumidor/huésped (Dimitrellou et al., 2016). Particularmente, la resistencia al pH bajo (pH 1,5 - 3,0) del estómago es uno de los criterios más importantes en la selección de probióticos (Solieri et al., 2014). Narimani et al. (2015) clasificaron 144 cepas en 4 grupos de acuerdo con la tasa de supervivencia a pH 2,5 por tres horas en susceptible (Tasa de supervivencia <10 %), moderadamente resistente (Tasa de supervivencia 10 - 60 %), resistencia buena (Tasa de supervivencia 60 - 80 %) y resistencia muy buena (Tasa de supervivencia >80 %). De acuerdo a la clasificación mencionada, L. lactis GU967439 es clasificado como muy resistente a pH3 (Tasa de supervivencia 94,7 %) y moderadamente resistente a pH 2,5 y 2 (Tasa de supervivencia 55,19 % y 45,05 % respectivamente). Sin embargo, no se conoce con exactitud si la resistencia a la simulación de las condiciones gástricas infiere de forma efectiva la tolerancia al ambiente gástrico in vivo.

Los alimentos funcionan como vehículos protectores de las cepas probióticas. Específicamente, los quesos presentan características que favorecen la viabilidad de estos microorganismos. Entre ellas se encuentran la disponibilidad de nutrientes, la formación de una matriz sólida de grasa y proteína con alta capacidad buffer, un bajo contenido de oxígeno y pH alto en comparación a otros productos lácteos (Rolim et al., 2020). Por lo anterior, posiblemente la viabilidad de L. lactis GU967439 se incremente aún más al ser administrado como parte de productos lácteos.

Asimismo, la habilidad de tolerar las enzimas pancreáticas presentes en el intestino delgado es otro criterio de selección de bacterias probióticas (Padmavathi et al., 2018). En el presente estudio, la presencia de pancreatina no redujo significativamente el recuento de L. lactis GU967439, por lo que no representaría una barrera para su viabilidad. Otro factor estresante al que se exponen los probióticos son las sales biliares que desorganizan las membranas celulares bacterianas (Ruiz et al., 2013). Tras la incubación durante 240 minutos de L. lactis GU967439 con bilis al 0,3 %, no se encontraron diferencias significativas entre los recuentos iniciales y finales.

Actividad antimicrobiana

Lorenzo y Raffo (2015) demostraron la producción de diacetilo por L. lactis GU967439. Posteriormente, Rodríguez (2016) caracterizó el SLC y concluyó que la bacteriocina contenida posiblemente se trate de un lantibiótico distinto a la nisina. Más adelante, Hernández (2021) detectó mediante PCR la presencia del gen de la nisina en el genoma de L. lactis GU967439 y a su vez, el espectro de masas reveló una señal similar a la de la nisina Z. Por lo anterior, la mejor actividad antimicrobiana de L. lactis GU967439 es posible que se deba a que produce más de un compuesto con actividad antimicrobiana. Por otro lado, las bacteriocinas presentan una elevada actividad antimicrobiana frente a cepas relacionadas (Yongkiettrakul et al., 2019), lo que explicaría la ausencia de actividad frente a microorganismos Gram negativos testeados en este estudio.

Conclusiones

La demanda creciente de nuevos alimentos funcionales lleva a la necesidad de caracterizar y seleccionar nuevas cepas probióticas. En el presente trabajo se demostró que L. lactis GU967439 posiblemente no adquirió elementos de resistencia a antibióticos de otras cepas, representando una cepa segura para su consumo. Además, presentó una tasa de supervivencia adecuada a la simulación del jugo gástrico a pH 3, y resistió la presencia de pancreatina y bilis. Asimismo, el SLC de L. lactis GU967439 exhibió actividad inhibitoria in vitro frente a un amplio rango de microorganismos Gram positivos utilizados como indicadores y presentó mejor actividad que la cepa L. lactis ATCC N° 11454. Sin embargo, ni L. lactis ATCC N° 11454 ni L. lactis GU967439 presentaron actividad frente a los microorganismos Gram negativos empleados. Estos resultados dan lugar a futuros trabajos que permitan continuar caracterizando el potencial probiótico de L. lactis GU967439.

Agradecimientos

A la Comisión de Investigación y Desarrollo Científico (CIDEC), de la Facultad de Veterinaria, de la Universidad de la República.

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